Différence entre le séquençage et le pyroséquençage de Sanger

Le séquençage d'ADN est très important pour l'analyse d'ADN puisque la connaissance de l'arrangement correct des nucléotides sur une région d'ADN particulière révèle de nombreuses informations importantes à ce sujet. Il existe différentes méthodes de séquençage de l'ADN. Le séquençage Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes différentes de séquençage de l'ADN largement utilisées en biologie moléculaire. La différence clé entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage est que le séquençage de Sanger utilise des didésoxynucléotides pour terminer la synthèse d'ADN pour lire la séquence nucléotidique tandis que le pyroséquençage détecte la libération de pyrophosphate en incorporant les nucléotides et en synthétisant la séquence complémentaire séquence.

TABLE DES MATIÈRES

1. Vue d'ensemble et différence clé

2. Qu'est-ce que Sanger Sequencing
3. Qu'est-ce que Pyrosequencing
4. Comparaison côte à côte - Séquençage Sanger vs Pyroséquençage
5. Résumé
Qu'est-ce que le séquençage Sanger?
Le séquençage Sanger est une méthode de séquençage d'ADN de première génération développée par Frederick Sanger et ses collèges en 1977. Il est également connu sous le nom de

Séquençage de terminaison de chaîne

ou Dideoxy terminaison de chaîne par didésoxynucléotides (ddNTP). Cette méthode a été largement utilisée pendant plus de 30 ans jusqu'à ce que le séquençage de nouvelle génération (NGS) soit développé. La technique de séquençage Sanger a permis la découverte de l'ordre nucléotidique correct ou la fixation d'un fragment d'ADN particulier. Il repose sur l'incorporation sélective de ddNTP et la terminaison de la synthèse d'ADN au cours de la réplication d'ADN in vitro . L'absence de groupes OH en 3 'pour poursuivre la formation de liaisons phosphodiester entre des nucléotides adjacents est une caractéristique unique des ddNTP. Par conséquent, une fois que le ddNTP est attaché, l'allongement de chaîne cesse et se termine à partir de ce point. Il y a quatre ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP - utilisés dans le séquençage de Sanger. Ces nucléotides arrêtent le processus de réplication de l'ADN lorsqu'ils sont incorporés dans le brin croissant de l'ADN et conduisent à des longueurs variables d'ADN court. L'électrophorèse sur gel capillaire est utilisée pour organiser ces courts brins d'ADN en fonction de leur taille sur un gel, comme le montre la figure 01. Pour

in vitro

de l'ADN, peu d'exigences devraient être fournies. Ils sont l'ADN de l'ADN polymérase, l'ADN matrice, les amorces oligonucléotidiques et les désoxynucléotides (dNTP). Dans le séquençage Sanger, la réplication de l'ADN est réalisée dans quatre tubes à essai séparés avec quatre types de ddNTP séparément. Les désoxynucléotides ne sont pas totalement remplacés par les ddNTP respectifs. Un mélange du dNTP particulier (par exemple, dATP + ddATP) est inclus dans le tube et répliqué. Quatre produits de tube séparés sont exécutés sur un gel dans quatre puits séparés. Ensuite, en lisant le gel, la séquence peut être construite comme indiqué sur la figure 02.

Figure 02: Séquençage Sanger Le séquençage Sanger est une technique importante qui aide dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire. Le projet sur le génome humain a été complété avec succès à l'aide de méthodes basées sur le séquençage de Sanger. Le séquençage de Sanger est également utile dans le séquençage de l'ADN cible, la recherche sur le cancer et les maladies génétiques, l'analyse de l'expression des gènes, l'identification humaine, la détection de pathogènes, le séquençage microbien, etc.

. séquence ne peut pas être plus longue que 1000 paires de bases

Un seul brin peut être séquencé à la fois.

Le processus est long et coûteux.

Par conséquent, de nouvelles techniques avancées de séquençage ont été développées avec le temps pour surmonter ces problèmes. Cependant, le séquençage de Sanger est toujours utilisé en raison de ses résultats très précis jusqu'à environ 850 fragments de longueur de la paire de bases.

  • Qu'est-ce que le pyroséquençage?
  • Le pyroséquençage est une nouvelle technique de séquençage de l'ADN basée sur le "séquençage par synthèse". Cette technique repose sur la détection de la libération de pyrophosphate lors de l'incorporation des nucléotides. Le processus est employé par quatre enzymes différentes: ADN polymérisé, ATP sulfurylase, luciférase et apyrase et deux substrats adénosine 5 'phosphosulfate (APS) et luciférine.
  • Le processus commence avec la liaison de l'amorce avec la matrice d'ADN simple brin et l'ADN polymérase commence l'incorporation des nucléotides complémentaires à celle-ci. Lorsque les nucléotides se réunissent (polymérisation d'acides nucléiques), ils libèrent des groupes pyrophosphate (deux groupes de phosphates liés entre eux) et de l'énergie. Chaque addition de nucléotide libère une quantité équimolaire de pyrophosphate. Le pyrophosphate se transforme en ATP par ATP sulfurylase en présence de substrat APS. L'ATP généré entraîne la conversion de la luciférine en luciférase en oxyluciférine, produisant de la lumière visible en des quantités proportionnelles à la quantité d'ATP. La lumière est détectée par un dispositif de détection de photons ou par photomultiplicateur et crée un pyrogramme. L'apyrase dégrade l'ATP et les dNTP non incorporés dans le mélange réactionnel. L'ajout de dNTP est fait une fois à la fois. Puisque l'addition du nucléotide est connue en fonction de l'incorporation et de la détection de la lumière, la séquence de la matrice peut être déterminée.Le pyrogramme est utilisé pour générer la séquence nucléotidique de l'ADN de l'échantillon, comme le montre la figure 03.

Le pyroséquençage est très important dans l'analyse du polymorphisme d'un seul nucléotide et le séquençage de courts tronçons d'ADN. La haute précision, la flexibilité, la facilité d'automatisation et le traitement parallèle sont les avantages du pyroséquençage par rapport aux techniques de séquençage Sanger.

Figure 03: Pyroséquençage

Quelle est la différence entre le séquençage Sanger et le pyroséquençage?

Séquençage séquentiel vs pyroséquençage

Le séquençage Sanger est une méthode de séquençage d'ADN basée sur l'incorporation sélective de ddNTPs par ADN polymérase et terminaison de chaîne.

Le pyroséquençage est une méthode de séquençage de l'ADN basée sur la détection de la libération du pyrophosphate lors de l'incorporation du nucléotide.

L'utilisation de ddNTP

Les ddNTP sont utilisés pour mettre fin à la réplication de l'ADN

Les ddNTP ne sont pas utilisés. Les enzymes impliquées
ADN polymérase sont utilisées.
Quatre enzymes sont utilisées: l'ADN polymérase, l'ATP sulfurylase, la luciférase et l'apyrase. Les substrats utilisés
APS et Luciferin ne sont pas utilisés.
Le phosphosulfate d'adénosine 5 '(APS) et la luciférine sont utilisés. Température maximale
C'est un processus lent.
C'est un processus rapide. Résumé - Le séquençage Sanger vs le pyroséquençage
Le séquençage Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes de séquençage de l'ADN utilisées en biologie moléculaire. Le séquençage Sanger construit l'ordre des nucléotides en séquence en terminant l'allongement de la chaîne tandis que le pyroséquençage construit l'ordre précis des nucléotides en séquence par incorporation de nucléotides et détection de la libération de pyrophosphates. Par conséquent, la principale différence entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage est que le séquençage de Sanger fonctionne sur le séquençage par terminaison de chaîne tandis que le pyroséquençage fonctionne sur le séquençage par synthèse.
Référence: 1. Fakruddin, Md, et Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-une alternative au séquençage Sanger traditionnel. "Journal américain de biochimie et de biotechnologie. Publications scientifiques, 02 mars 2012. Web. 28 février 2017.

2. "Séquençage Sanger. "Séquençage Sanger - Sujets ScienceDirect. N. p. , n. ré. Web. 28 févr. 2017

Courtoisie d'image:

1. "Didesoxy-Methode" par Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, au sujet de la base de Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Par Enzo sur Wikipédia en polonais (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" par microbiologybytes (CC BY-SA 2. 0) via Flickr